激光共聚焦显微镜技术
激光共聚焦显微镜技术（Confocal Lasers Scanning Miccruscope CLSM)是将显微镜技术与激光技术有效的结合，对具有荧光标记的物的形态及功能，通过计算机控制可以对其单层面进行快速扫描，也可以对多个层面进行连续光片层扫描。逐层获得二维光学横断面图像，并可通过计算机三维重组软件支持，获得真三维图像。
激光共聚焦显微镜汇集了激光技术、显微镜技术、免疫荧光技术、计算机及图像处理技术、精密的机械技术等，高、精、尖细胞分析及工程技术于一体的新技术。使其成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
我们大家知道，从人类制作的第一台显微镜到现在以有几百年的历史来了，随着人类对生命科学研究的不断深入，各种显微镜应运而生，使得研究细胞的手段以更加精密化和多样化。共聚焦显微镜的理论是在1957年Marvin Minsky提出的，但共聚焦显微镜作为商品推出是在20世纪80年代初期，早期的激光共聚焦显微镜在技术上很不完善，其应用也受到限制。至到20世纪80年代末，光学系统设计不断改进，成像的质量和灵敏度都有所提高，进入90年代初，激光共聚焦显微镜系统中逐步引入混合激光和紫外激光技术。90年代末由美国Meridian公司推出的新型激光共聚焦显微镜系统，已具备完善的光学系统，模块化的仪器设计，灵活的软件和高配置的计算机硬件，从而使共聚焦显微镜系统的功能不断升级，应用的领域不断扩展。随着生命科学研究的不断深入及荧光探针技术的迅速发展，共聚焦显微镜将推动生命科学研究的迅速发展，同时生命科学研究的进展也将使激光显微镜技术不断改进和完善。
激光共聚焦显微镜是现今最为先进的光学显微镜，其主要优点为：以激光为光源，在相应的荧光探针标记后，对样本进行逐点扫描，逐层获得二维光学横断面图像，具有“细胞CT”的功能，并可通过计算机三维重建软件支持，获得真三维图像，并可以任意角度旋转，观察细胞，组织立体形态和空间关系；可以对活细胞和组织进行无损伤的观察，动态测量细胞内的Ca离子浓度和pH值等活细胞生理信息；可对细胞膜的流动性，细胞间通讯，细胞融合，细胞骨架弹性测量等，可用作“光刀子”完成细胞内“外科手术”。这一技术使得对活细胞和组织进行原位，动态，定量的观察和测量的梦想成为现实。
第一章 光学显微镜显微镜的基本原理
我们大家知道，“工欲善其事，必先利其器”光学显微镜不仅是发现细胞的必要手段，也是生命科学研究基本技术条件。
第一节 普通显微镜的基本结构和原理
普通显微镜利用光线照明，标本中的各点以其光吸收（即光的振幅发生变化）的不同而在明亮的背景中成像。它是由光学系统；机械系统；光源组成。
（一）光学系统
1． 目镜 它是插在目镜筒顶部的镜头，由一组透镜组成，可以使物镜成倍地分辨、放大物像，例如10X、15X等。按照所能看到的视场大小，目镜可分为视场较小的普通目镜，和视场较大的大视场目镜(或称广角目镜)两类。较高档显微镜的目镜上还装有视度调节机构，操作者可以方便快捷地对左右眼分别进行视度调整；此外，在这些目镜上可以加装测量分划板，测量分划板的象总能清晰地调焦在标本的焦面上；并且，为了防止目镜被取走以及减少运输中被损坏的可能性，这些目镜可以被锁定。
2． 物镜 它安装在转换器的孔上，也是由一组透镜组成的，能够把物体清晰地放大。物镜上刻有放大倍数，主要有10X、20X、40X、60X 100X等。高倍物镜中多采用浸液物镜，即在物镜的下表面和标本片的上表面之间填充折射率为1.4左右的液体（如杉木油），它能显著的提高显微观察的分辨率。
物镜的主要参数：
放大率
放大率就是放大倍数，是指被检验物体经物镜放大再经目镜放大后，人眼所看到的最终图象的大小对原物体大小的比值。是物镜和目镜放大倍数的乘积。放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好，在选择时应首先考虑物镜的数值孔径。
数值孔径：
数值孔径简写NA，数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志。其数值的大小，分别标科在物镜和聚光镜的外壳上。数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（h）和孔径角（u）半数的正玄之乘积。用公式表示如下：NA=hsinu/2
孔径角又称“镜口角”，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。显微镜观察时，若想增大NA值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率h值。基于这一原理，就产生了水浸系物镜和油浸物镜，因介质的折射率h值大于一，NA值就能大于一。数值孔径最大值为1.4，这个数值在理论上和技术上都达到了极限。目前，有用折射率高的溴萘作介质，溴萘的折射率为1.66,所以NA值可大于1.4。这里必须指出，为了充分发挥物镜数值孔径的作用，在观察时，聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值，
数值孔径与其他技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数。它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。
分辨率：
分辨率又称“鉴别率”，“解像力”。是衡量显微镜性能的又一个重要技术参数。显微镜的分辨率用公式表示为：d=l/NA式中d为最小分辨距离；l为光线的波长；NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大，照明光线波长越短，则d值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即减小d值，可采取以下措施
1．降低波长l值，使用短波长光源。
2．曾大介质h值和提高NA值（NA=hsinu/2）。
3．增大孔径角。
4．增加明暗反差。
焦深：
焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。
焦深大, 可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层，焦深与其他技术参数有以下关系：
1．焦深与总放大倍数及物镜的数值孔镜成反比。
2．焦深大，分辨率降低。
视场直径（Field of view）：
观察显微镜时，所看到的明亮的原形范围叫视场，它的大小，是由目镜里的视场光阑决定的。视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大，愈便于观察。
1．视场直径与视场数成正比。
2．增大物镜的倍数，则视场直径减小。因此，若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，而换成高倍物镜，就只能看到被检物体的很小一部份。
覆盖差：
显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成响质量。国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm, 许可范围在0.16—0.18mm.,在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。物镜外壳上标科的确0.17,即表明该物镜要求盖玻片的厚度。
工作距离：
工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。镜检时，被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是调节工作距离。在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。
3．光源 ：有卤素灯、钨丝灯、汞灯、荧光灯、金属卤化物灯等。
4．聚光器： 包括聚光镜、孔径光阑。聚光镜由透镜组成，它可以集中透射过来的光线，使更多的光能集中到被观察的部位。孔径光阑可控制聚光器的通光范围，用以调节光的强度。
（二）机械装置
1． 机架 显微镜的主体部分，包括底座和弯臂。
2． 目镜筒 位于机架上方，靠圆形燕尾槽与机架固定，目镜插在其上。根据有否摄像功能，可分为双目镜筒和三目镜筒；根据瞳距的调节方式不同，可分为铰链式和平移式。
3． 物镜转换器 它是一个旋转圆盘，上有3～5个孔，分别装有低倍或高倍物镜镜头。转动物镜转换器就可让不同倍率的物镜进入工作光路。
4． 载物台 是放置玻片的平台，其中央具有通光孔。台上有一个弹性的标本夹，用来夹住载玻片。右下方有移动手柄，使载物台面可在XY双方向进行移动。
5． 调焦机构 利用调焦手轮可以驱动调焦机构，使载物台作粗调和微调的升降运动，从而使被观察物体对焦清晰成像。
6． 聚光器调节机构 聚光器安装在其上，调节螺旋可以使聚光器升降，用以调节光线的强弱。
第二节 光学显微镜的分类
光学显微镜有多种分类方法：
按使用目镜的数目可分为双目和单目显微镜；按图像是否有立体感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜；按观察对像可分为生物和金相显微镜等；按光学原理可分为偏光、相衬和微差干涉对比显微镜等；
按光源类型可分为普通光、荧光、紫外光、红外光和激光显微镜等；按接收器类型可分为目视、数码（摄像）显微镜等。常用的显微镜有双目体视显微镜、金相显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜等。
第二章 荧光显微镜的基本结构和原理第一节 荧光显微镜的基本结构和原理
荧光显微镜是利用较短波长的光是样品受到激发，产生较长波的荧光，可用来观察和分辨样品中产生荧光物质的成分和位置。任何一种荧光物质都有的有的吸收光谱和发射光谱，荧光发射光谱比吸收光谱的波长偏长波方向，但二者有部分重叠。
荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光365或紫蓝光420)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源 、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。荧光光源——般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。
（一）光源
高压汞灯或氙灯是常用的荧光激发光源，汞灯在366nm 、405nm、436nm、546nm、577nm处有很强的发射线；氙灯也在光的紫外区、可见区有较强的发射线。
（二）光学系统
（1）物镜由于激发标本和收集荧光都是由同一物镜实现的，所以物镜的选择尤为重要，我们选择的标准是能透过紫外光的特制物镜，荧光效率与所用物镜数值孔径的4次方成正比，所以用数值孔径较大浸油物镜效果较好。
（2）目镜荧光亮度与目镜放大倍数的平方成反比。
（3）激发滤片放置于光源和物体之间，其作用是选择适宜于激发欲观察荧光物质的波长范围。
（4）阻断滤片采用长波通滤片，即使长于某波长的光通过，短于某波长的光不能通过，进一步使荧光与激发光分离，已获更纯的荧光。内阻断铝片以固定在内部，外阻断滤片可跟需要装入或卸下。
（5）双色反色镜他放置方向与激发光的方向呈45°，具有一个特定波长值m。波长长于m的光被透射，波长短于m的光波被反射，所以它是初分离激发光（较短波长）和发射荧光（较长波长）的一个重要组件。
第二节 荧光显微镜的分类及使用注意事项
（一）荧光显微镜一般分为透射和落射式两种类型。
a. 透射式：激发光来自被检物体的下方，聚光镜为暗视野聚光镜，使激发光不进入物镜，而使荧光进入物镜。它在低倍情况下明亮，而高倍则暗，在油浸和调中时，较难操作，尤以低倍的照明范围难于确定，但能得到很暗的视野背景。透射式不使用于非透明的被检物体。
b. 落射式：透射式目前几乎被淘汰，新型的荧光显微镜多为落射式，光源来自被检物体的上方，在光路中具有分光镜，所以对透明和不透明的被检物体都适用。由于物镜起了聚光镜的作用，不仅便于操作，而且从低倍到高倍，可以实现整个视场的均匀照明。
（二）荧光镜检术的注意事项
a. 激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象，因此尽可能缩短观察时间，暂时不观察时，应用挡板遮盖激发光。
b. 作油镜观察时，应用"无荧光油"。
c. 荧光几乎都较弱，应在较暗的室内进行。
d. 电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。
目前许多新兴生物研究领域应用到荧光显微镜，如基因原位杂交（FISH）等等。
第三章 激光共聚焦显微镜的基本结构
激光共聚焦显微镜主要是由 激光照射系统（氩离子激光气器、氦乃红、氦乃绿激光器和声光调节器）、显微镜系统（倒或正置荧光显微镜和共聚焦系统组成）、检测系统（检测器和检测放大器）、X-Y平台系统、Z轴步进马达、计算机系统
（一） 激光照射系统
激光器是一种产生激光束的装置，它保证光子在其中持续震荡、反复放大得到大量的特征相同的光子，从而产生持续不断的激光束。迄今为止，在21nm～7mm范围内，用各种激光器可产生几千个激光波长，但其中只有少量谱线能够用作共聚焦显微镜的光源。通常采用的激光谱线有：Ar-458nm，476nm，488nm，514nm；Kr-568nm、647nm，HeNe-543nm、633nm;Ar(UV)-351nm、364nm为紫外光线；蓝紫光半导体激光器发出405nm的激光。作为激光光源可单独或同时配备多个激光器，以获得更多的激光谱线，满足大多数常用荧光探针的需要。因此，不同的仪器激光谱线数目及功率的大小根据所配置的激光器不同而有所差异。选配合理，基本能满足多种荧光物质的测定。
（二） 显微镜系统
荧光显微镜是激光扫描共聚焦显微镜的一个重要组成部分。它配备两个光源：卤素灯光源和汞灯光源，主要是用于预览样品，其中卤素灯光源用于寻找样品焦平面、观察样品位置、形态和分布；汞灯用于观察和分辨样品中产生荧光物质的成分和位置。对于光敏（例如淬灭）的样品最好用卤素灯进行预览，以减少对样品的刺激。激光共聚焦显微镜系统所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但是又有其特点。
（1）激光共聚焦显微镜系统中，其侧面打开了一个于扫描器相连接的接口，使激光能够由此进入显微镜的物镜照射到样品上，并使样品发射的萤光到达检测器。
（2）荧光显微镜的载物台上装有微量步进马达，以驱动载物台在垂直（z轴）方向移动，用于共聚焦显微镜获取不同层面光学切片，这些光学切片是共聚焦显微镜获取三维荧光图像的基础。Z轴步距的大小决定了光学切片的厚度，而z轴的步距是由实验者输入相应的指令来控制的。
（3）用高倍镜观察样品尤其是进行动态监测时，最好配备倒置显微镜，以便适应多种样品的观察，例如Petri 皿中培养的细胞样品。
（4）荧光镜座要装有防震动的装置，防止在激光扫描样品、采集图像过程中发生载物台在任何方向上的移动。
（5）装有光路转换装置。预览时使用汞灯作为激发光，样品发射的荧光进入目镜或照相系统；正式采集共焦图像时用激光光源激发样品，发射的荧光进入扫描头中的检测器。这两套激发光源及发射光系统不能同时使用，要配备光学和机械系统进行光路转换。
（6）要配备高数值孔径的油浸或水浸物镜采集样品精细机构的图像。显微镜物镜镜头及光路系统均与扫描器光路系统相匹配，同时由于各种波长的激发光和荧光都通过物镜，所以物镜要保证各波长范围内的透光性。
(7) 汞灯光线的强度可调，以便根据样品中荧光物质的强弱及光敏的程度调节激发光的强度，保证样品在预览过程中的荧光强度不发生变化，这对于后面用共聚焦显微镜进一步准确定量很重要。
（8）载物台支架和附件的配备要能适应多种样品器皿和测试要求。因此需要配备相应的支架和附件。常用的样品支架有：载玻片支架、大小Petri皿支架、大小平皿支架、控温架CO2。通气装置等。
（9）荧光显微镜的参数要与光路系统。计算机控制软件系统相匹配。
（三）计算机系统
共聚焦显微镜仪器的各个部分由计算机予以设置和调控，使光线精确地按照设计要求扫描样品，多有检测信号均可被存于多维的图像储存器内，并对图像资料作进一步的加工处理。计算机还可以存储测定样品的条件，以便重复试验。共焦图像文件大，每一幅单色图像要处理256kb以上，而且每一次采集图像，一般需要将几幅甚至上百幅图像作为一个文件存储，因此对计算机软件功能、运行速度，内存、硬盘要求很高，近几年来计算机软件功能日益强大，运行速度快，内存、硬盘存储容量大，基本满足了激光共聚焦显微镜技术的要求。
第二节 激光共聚焦显微镜基本原理
激光扫描共聚焦显微镜成像原理如图1所示，激光器发出的激光束经过扩束透镜和光束整形镜，变成一束直径较大的平行光束，长通分色反射镜使光束偏转90度，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质在激光的激发下发射沿各个方向的荧光，一部分荧光经过物镜、长通分色反射镜、聚焦透镜、会聚在聚焦物镜的焦点处，再通过焦点处的针孔，由检测器接收。
第三节 共聚焦显微镜系统优点
可对固定或者活的细胞、组织切片进行连续断层扫描，获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器、细胞膜等系统的三维图像，
高水平分辨率
普通显微镜 0.61λ/NA；共聚焦显微镜 0.55λ/NA
实时多通道荧光（荧光平衡）、透射DIC观测
数字化图像，可以进行图像处理和定量分析
离子浓度测定，即检测细胞内钠、钙、镁、pH等离子浓度及观察其动态变化
光谱功能；光诱导功能；荧光寿命成像功能；活体多光子显微观察功能。
共聚焦显微技术应用
细胞生物学如：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡机制；各种细胞器、结构性蛋白、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞特异性结构的含量、组分及分布进行定量分析；利用特定的抗体对紫外线引起的DNA损伤进行观察和定量；分析正常细胞与癌细胞的细胞骨架及其与核改变之间的关系；细胞黏附行为等
生物化学如：酶、核酸、受体分析、荧光原位杂交、染色体基因定位等，利用共聚焦技术可以取代传统的核酸印迹染交等技术，进行基因的表达检测，使基因的转录、翻译等检测变的更加简单、准确
药理学如：药物对细胞的作用及其动力学；药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量分析
生理学、发育生物学如：膜受体，离子通道，离子含量、分布与动态变化；动物发育以及胚胎的形成，干细胞的分化等；细胞膜电位的测量，荧光漂白后恢复（FRAP）的测量等。
遗传学和组胚学如：细胞生长、分化，细胞的三维结构，染色体分析，基因表达，基因诊断等
神经生物学如：神经细胞结构，神经递质的成分、运输和传递
微生物学和寄生虫学如：细菌、寄生虫形态结构
病理学及病理学临床应用如：活检标本的快速诊断，肿瘤诊断，自身免疫性疾病的诊断
免疫学、环境医学和营养学如：免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位，细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布，两种以上蛋白的共存与共定位，蛋白与细胞器的共定位，动态实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中的时空表达等